產(chǎn)品名稱：Inspire Spark©PrimeRNP Kit
產(chǎn)品貨號：MJ5460 （ 50 rxn）、MJ5461 （20 rxn）、MJ5462（6 rxn）
產(chǎn)品簡介
InspireSpark©PrimeRNP Kit試劑盒（貨號：MJ5460）是一款基于自遞送 CRISPR/SpCas9系統(tǒng)的基因編輯工具，專為基因敲除（KO）和基因敲入（KI）實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計。通過創(chuàng)新的遞送機(jī)制，無需依賴電轉(zhuǎn)儀等復(fù)雜設(shè)備即可在原代細(xì)胞及各類細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)高效編輯，經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證，基因敲除、基因敲入效率達(dá) 85-90%，同時保持極低脫靶率及無細(xì)胞毒性特性，為研究者提供安全可靠的實(shí)驗(yàn)解決方案。
儲存條件與有效期
短期儲存：解凍后保存于-20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。
長期儲存：未開封試劑盒保存于-80℃冰箱。開封后如長期不使用保存于-80℃冰箱 。
有效期：18個月
實(shí)驗(yàn)步驟
以人原代T細(xì)胞（1x106個細(xì)胞）為例.
一. 轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物制備
1.取1.5μL SgRNA（100μM）與1.5μL Solution I 于1.5mL（DNase-Free、RNase-Free）離心管中混合，37℃孵育5-10分鐘，形成RNP復(fù)合物。
注： 先加SgRNA再加Solution I
2. 加入50μL預(yù)平衡至室溫的Solution II（使用前渦旋混勻），充分混勻后室溫靜置5分鐘
二. 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)
1. 預(yù)處理細(xì)胞：激活1x106個T細(xì)胞48小時后，以300xg離心洗滌并轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)板，次日進(jìn)行編輯操作。
2. 離心收集細(xì)胞，徹底移除培養(yǎng)基（建議使用OptiMEM或PBS清洗殘留）。
3. 將細(xì)胞沉淀重懸于制備好的轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物溶液中，輕柔混勻后，37℃孵育45分鐘。
三. 細(xì)胞培養(yǎng)與效率檢測
1. 向轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞混合液中加入600μL含10% FBS及200U IL-2的T細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸后接
種至24孔板，維持細(xì)胞密度為2-3×10?/mL。
2. 37℃培養(yǎng)4-5天后，檢測基因編輯效率。
注意事項(xiàng)與擴(kuò)展應(yīng)用
1. AAV輔助敲入（KI）：若需聯(lián)合 AAV（MOI: 2×10?-5×10?）進(jìn)行KI，按以下操作：
AAV體積 ≤ 5μL時：于步驟一（RNP制備階段）加入。
AAV體積＞5μL時：于步驟三（細(xì)胞培養(yǎng)階段）加入。
2. 慢病毒輔助實(shí)驗(yàn)：激活24小時后感染，72小時進(jìn)行編輯轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3. 多基因編輯：
- 方案A：步驟一中混合多靶點(diǎn)RNP復(fù)合物。
- 方案B：在不同時間點(diǎn)分步轉(zhuǎn)導(dǎo)不同RNP復(fù)合物。
4. 細(xì)胞狀態(tài)要求：轉(zhuǎn)導(dǎo)前需確保細(xì)胞活性＞90%，編輯效率與細(xì)胞狀態(tài)直接相關(guān)。
5. 電轉(zhuǎn)兼容性：Solution I 中的eSpCas9蛋白可單獨(dú)用于電轉(zhuǎn)，效率較野生型提升30%。
貼壁細(xì)胞需消化離心后按上述步驟操作。
6. 本實(shí)驗(yàn)需使用DNase-Free、RNase-Free耗材。
常見問題：
InspireSpark® PrimeRNP Kit Q&A
Q：T細(xì)胞激活48小時后離心清洗的清洗液及鋪板培養(yǎng)基要求？
A：清洗液為實(shí)驗(yàn)原用的T細(xì)胞培養(yǎng)基。操作流程：輕柔吹吸重懸細(xì)胞 → 離心（400 ×g, 5
min）→ 徹底棄上清 → 用新鮮配制的同款T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。目的：防止T細(xì)胞過度激
活、去除碎片、優(yōu)化細(xì)胞狀態(tài)。
Q：實(shí)驗(yàn)步驟中FBS能否替換為其他添加劑？
A：可使用人AB血清或無血清培養(yǎng)基（注：無血清條件下細(xì)胞生長狀態(tài)可能減弱）。
Q：轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基含IL-2或血清替代物是否影響轉(zhuǎn)導(dǎo)？
A：無影響。通過離心清洗徹底棄除上清（避免血清蛋白干擾），最終使用轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物重懸
細(xì)胞沉淀即可。
Q：同時編輯兩個基因是否需要配置兩份混合液？能否同時加入細(xì)胞？
A：僅需將RNP1與RNP2加入同一份Solution II中孵育，無需分裝多份Solution II?；旌虾蟮?
復(fù)合物可同時加入細(xì)胞。
Q：敲除（KO）和敲入（KI）能否同時實(shí)現(xiàn)？最多支持幾個基因編輯？
A：支持同步操作。多基因編輯需在制備轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物時進(jìn)行多RNP制備，或分次轉(zhuǎn)導(dǎo)（建議
：首次轉(zhuǎn)導(dǎo)≤2個基因，間隔48小時后再轉(zhuǎn)導(dǎo)≤2個基因）。
Q：Solution II能否搭配其他廠家的Cas9蛋白？是否支持電轉(zhuǎn)
A：可以使用，但未經(jīng)大量數(shù)據(jù)驗(yàn)證，無法保證其編輯效率。
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紅榮微再 MJ5461：精準(zhǔn)基因編輯方案，突破電轉(zhuǎn)瓶頸 · 原代細(xì)胞高效編輯 · 85-90% KO/KI效率
