「當(dāng)您做單細(xì)胞全基因組研究時(shí)」

獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測(cè)序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴(kuò)增，在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)誕生的近二十年時(shí)間里，全基因組擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。

DOP-PCR：

技術(shù)原理：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機(jī)序列，可以隨機(jī)的和基因組DNA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的擴(kuò)增。

應(yīng)用范圍：因?yàn)镻CR的指數(shù)擴(kuò)增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對(duì)染色體的CNV進(jìn)行定量。

MDA：

技術(shù)原理：2001年由Laskin團(tuán)隊(duì)發(fā)明，使用隨機(jī)的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴(kuò)增產(chǎn)生50~100kb的DNA片段。同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對(duì)活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性^[2]。

應(yīng)用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對(duì)SNV的分析，以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢(shì)。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴(kuò)增，因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此MDA法不適合進(jìn)行CNV的分析。

MALBAC：

技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團(tuán)隊(duì)發(fā)明，擬線性的擴(kuò)增過程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機(jī)序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過8~12個(gè)循環(huán)的擬線性擴(kuò)增后，再對(duì)這些環(huán)狀的擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增^[3]。

應(yīng)用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢(shì)在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細(xì)胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過對(duì)參考細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行CNV的分析；另外，由于其擴(kuò)增的均一性，MALBAC法擴(kuò)增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測(cè)SNV時(shí)將會(huì)出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴(kuò)增的區(qū)域有時(shí)會(huì)在擴(kuò)增過程中丟失。