疏水作用層析 (HIC) 是在蛋白天然的狀態(tài)下用于分離純化蛋白使用最為廣泛的方法。HIC也被證明是非常有用的工具在分離蛋白復(fù)合物和研究

蛋白折疊和解折疊。因此，HIC如何發(fā)揮作用? 在技術(shù)后面的原理是什么? 去理解在這類色譜后面的原理，如下幾點(diǎn)你肯定需要了解。

HIC如何發(fā)揮作用?

      簡言之，HIC (也叫鹽析)使用疏水性的特點(diǎn)來分離蛋白. 在這個方法操作中，包含親水和疏水區(qū)域的蛋白在高鹽緩沖液條件下加入到HIC柱子

中。緩沖液中的鹽 (通常是硫酸銨)降低了樣本溶質(zhì)的溶解 從而暴露出了蛋白分子表面的疏水區(qū)域。這協(xié)助這些疏水區(qū)域到柱子固相支撐物疏水區(qū)域

的吸附，最終使溶液中的蛋白沉淀（結(jié)晶）出來.請記住當(dāng)進(jìn)行這種類型的色譜時, 加入的感膠離子鹽增強(qiáng)了疏水效果同時降低了單獨(dú)疏水區(qū)域數(shù)量

和體積。當(dāng)降低鹽濃度會導(dǎo)致從固相支持物上的解吸附. 以此類推，樣品的洗脫可以通過降低鹽的濃度來實(shí)現(xiàn)。溫和的有機(jī)溶液修飾劑或去污劑或

許也可以加到洗脫液中來協(xié)助洗脫的過程。使用HIC的原理, 你可以從水溶液中在各種程度下結(jié)合蛋白，結(jié)合程度取決于目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)，鹽濃度，

PH值，溫度和使用的有機(jī)溶劑。

疏水作用層析: 揭示潛在的理論 

      有三種主要的理論能夠幫助解釋在HIC背后的機(jī)理 – (1) 鹽析理論 (2) 熱動力學(xué)理論以及 (3)表面張力或范德華力理論.

鹽析理論

       根據(jù)鹽析理論, 這些疏水氨基酸行成被保護(hù)的疏水區(qū)域一旦在水溶液中發(fā)生折疊然而親水性氨基酸允許蛋白去和水中的氫鍵發(fā)生結(jié)合。 結(jié)果是

溶解在水中的蛋白會增加如果有足夠的親水區(qū)域存在于蛋白分子表面.

       然而，一旦在溶液中加入抗離液劑鹽 (比如硫酸銨和硫酸鈉), 一些水分子將會和鹽離子發(fā)生作用而不是和蛋白質(zhì)的電荷部分. 當(dāng)溶液中蛋白和

蛋白的相互作用比溶劑溶質(zhì)的相互作用更加強(qiáng)的話, 蛋白分子會和另外一個蛋白分子自由發(fā)生相互作用 – 從而使他們發(fā)生集結(jié)最終從溶液中沉淀出

來。因此，溶液中鹽的加入在不同程度上降低了不同蛋白的溶解性。

熱動力學(xué)理論 

      這個理論說明疏水分子之間的相互作用是一個熵驅(qū)動的過程，基于熱動力學(xué)第二定律。在一種極性溶劑中兩個或多個非極性分子之間的疏水作

用是一種熵變化的自發(fā)過程。然而，這種作用可以通過控制溫度或修改溶劑的極性來發(fā)生改變。

     因此，當(dāng)一種非極性的分子和一種極性的溶劑比如說水接觸的時候,圍繞著疏水性分子的溶劑分子會有一定程度的增加。只要焓不顯著增加，這

會導(dǎo)致熵的降低同時會給吉布斯能一個正向的變化。 同樣，非極性分子溶解到極性溶劑中不會發(fā)生自發(fā)的反應(yīng)因?yàn)檫@不是熱動力學(xué)傾向性的.

     然而，當(dāng)你將兩種或更多種非極性分子放到一個極性的環(huán)境中, 大分子的疏水表面會從極性環(huán)境中隱藏起來，同時疏水分子會自發(fā)的發(fā)生聚集。

這種高度結(jié)構(gòu)性的溶劑分子周邊被暴露出來的疏水分子的表面所環(huán)繞將會被包含少量結(jié)構(gòu)分子的大量溶劑所替換。造成的結(jié)果是，熵增加同時吉布

斯能降低。在這種情況下，疏水作用變成一種熱動力學(xué)傾向性的過程。

表面張力，范德華力理論

     這種理論認(rèn)為在HIC中的疏水作用是取決于蛋白和固定的配基之間的范德華力因?yàn)樵邴}析鹽的存在下，隨著水的有序結(jié)構(gòu)的增加這些力會增加